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Stratégies pour l'expression de la protéine E. coli à haute efficacité

Temps de mise à jour : 2020-11-12

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Stratégies pour l'expression de la protéine E. coli à haute efficacité
Le système d'expression d'E. Coli est le système d'expression le plus ancien et le plus mature. En raison de son patrimoine génétique clair, de sa reproduction rapide, de son faible coût, de son niveau d'expression élevé, de sa purification facile des produits d'expression, de sa bonne stabilité, de sa forte capacité anti-pollution et de sa large gamme d'applications, c'est un outil puissant pour la recherche fondamentale et la production commerciale de protéines recombinantes. ; mais avec cela En même temps, le système d'expression procaryote présente encore de nombreuses lacunes qui sont difficiles à surmonter: telles que la protéine recombinante instable, une faible activité biologique et une expression sous forme de corps d'inclusion. L'efficacité d'expression de gènes étrangers dans E. coli est affectée par de nombreux facteurs. Ce n'est qu'en analysant et en optimisant la protéine cible avant l'expression que l'expression efficace de la protéine cible peut être obtenue, en incluant principalement les aspects suivants:

(1) Le choix du vecteur d'expression.

Le choix du promoteur du vecteur d'expression est très important. La structure du promoteur affecte son affinité avec l'ARN polymérase, affectant ainsi le niveau d'expression génique. Le promoteur idéal doit satisfaire:

① Il a une forte propriété d'amorçage et peut guider une transcription efficace pour assurer un rendement élevé de la protéine cible;
②Il peut être strictement réglementé, et l'expression peut être induite dans certaines conditions, ce qui peut minimiser la charge métabolique des bactéries et les effets toxiques des protéines étrangères. D'autres, tels que la position de la séquence SD et le terminateur de transcription, affecteront également l'efficacité de la transcription et de la traduction.

(2) Optimisation des codons.

Lorsque des gènes contenant un grand nombre de codons rares sont exprimés dans E. coli, le manque de certains ARNt dans E. coli réduira l'efficacité et la stabilité de la traduction de l'ARNm, et même entraînera des erreurs de traduction ou une terminaison prématurée. La modification des codons du gène cible peut améliorer la stabilité et l'efficacité de la traduction de l'ARNm.


(3) Protéines de fusion et chaperons moléculaires.

Les protéines de fusion peuvent non seulement être utilisées comme marqueurs d'affinité pour faciliter les opérations de purification en aval, mais aussi les protéines de fusion macromoléculaires peuvent augmenter l'expression soluble de protéines, telles que la glutathion-S transférase (GST), la protéine SUMO, la protéine de liaison au maltose (MBP), qui est hautement hydrophile, contribue à améliorer la solubilité et la stabilité de la protéine cible; la co-expression de chaperons moléculaires peut favoriser le repliement post-traductionnel et le traitement des protéines recombinantes, et améliorer la solubilité et la stabilité de la protéine.

Les systèmes GroEL et GroES sont couramment utilisés dans le système E. coli; le système ternaire de la protéine de choc thermique DnaK, DnaJ et GrpE; Famille Dsb (liaison disulfure réductase et isomérase), qui peut favoriser la formation de liaisons disulfure.


(4) La localisation et l'expression de la protéine cible.

Après la synthèse de la protéine recombinante dans E. coli, il y a 4 localisations, à savoir dans le cytoplasme, l'espace périplasmique, la membrane interne ou externe et la matrice extracellulaire.

Utilisez des peptides signaux pour sécréter des protéines recombinantes dans le périplasme ou le milieu extracellulaire. L'environnement oxydatif dans l'espace périplasmique est propice à la formation de liaisons disulfure et au repliement correct des protéines à base de thio; la protéase dans l'espace périplasmique est inférieure à celle de la cellule Many, pour réduire la dégradation de la protéine cible; le nombre de protéines dans l'espace périplasmique est également bien inférieur à celui de la cellule, ce qui est propice à la purification de la protéine cible.


(5) Sélection des souches d'expression.

Trop de protéases endogènes dans la souche peuvent provoquer l'instabilité des produits d'expression exogènes. Par conséquent, certaines souches déficientes en protéase deviennent souvent des souches d'expression initiale idéales.

La série Rosetta2 complète les ARNt (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA et CGG) correspondant à sept codons rares manquant d'E. Coli, et améliore le niveau d'expression des gènes étrangers, en particulier des gènes eucaryotes, dans le système procaryote; K-12 Les souches dérivées de la série Origami 2, les souches de double mutant trxB et gor, augmentent considérablement la probabilité de formation de liaisons disulfure dans le cytoplasme et favorisent l'expression des protéines solubles. Rosetta-gami ™ combine les avantages des deux types de souches ci-dessus.

Il complète non seulement 7 types de codons rares, mais favorise également la formation de liaisons disulfure et aide à exprimer les protéines eucaryotes qui nécessitent l'aide de liaisons disulfure pour former une conformation repliée correcte.


(6) Conditions d'induction et conditions de culture

Les conditions d'induction et les conditions de culture sont également critiques pour l'expression de protéines recombinantes, telles que la température. Lorsque la température est plus élevée, l'expression de la protéine est élevée mais il est facile de former des corps d'inclusion, tandis que lorsque la température est basse, l'expression de la protéine est faible, mais elle peut augmenter la protéine cible Solubilité; la concentration de l'inducteur affecte également l'efficacité d'expression de la protéine recombinante, comme l'induction d'IPTG à faible concentration peut augmenter la teneur en protéine soluble.

De plus, la composition nutritive, le pH et d'autres paramètres du milieu peuvent affecter l'activité, la sécrétion et le niveau d'expression de la protéase.



Pour exprimer des protéines étrangères dans E. coli, l'analyse avant expression est très importante. Une analyse spécifique du gène et de la protéine cibles, un examen complet et la sélection du système et de la méthode d'expression les plus appropriés peuvent atteindre une expression à haute efficacité de protéines étrangères.