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Protocole d'expression et de purification des protéines

Temps de mise à jour : 2020-10-15

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Protocole d'expression et de purification des protéines

L'étude des fonctions protéiques et la production de protéines fonctionnelles sont fondamentalement inséparables de l'expression hétérologue et de la purification des protéines.

Aujourd'hui, je vais vous parler de l'expression et de la purification des protéines sous les aspects suivants.


1. Sélection d'étiquettes


Les balises d'expression couramment courantes sont His-tag (histidine tag), GST-tag (glutathione sulfhydryl transferase tag), MBP-tag (maltose binding protein tag), CBD-tag (chitin binding region tag)) Attendez.

Chaque étiquette a des propriétés uniques, telles que le poids moléculaire de l'étiquette, sa capacité à réguler la solubilité des protéines, son effet sur le repliement des protéines, si elle doit être excisée, etc.

Choisissez une étiquette adaptée en fonction des caractéristiques de la protéine que vous souhaitez purifier. L'étiquette est bien sélectionnée, et les expériences suivantes obtiendront le double du résultat avec la moitié de l'effort.

2. Construction de vecteurs


Après avoir sélectionné l'étiquette à utiliser, il est nécessaire de préparer un vecteur d'expression. À l'heure actuelle, il existe de nombreux vecteurs commercialisés parmi lesquels choisir, tels que la série pET28 avec His-tag et la série pMAL avec MBP-tag.

La plupart des séries de vecteurs comprennent la forme d'insertion de l'étiquette dans le N-terminal ou le C-terminal, qui peut être sélectionné de manière flexible en fonction des caractéristiques de la protéine.

Lors de l'insertion du gène codant pour la protéine, vous devez faire attention à éviter le décalage de cadre. Si vous souhaitez construire un vecteur à partir de zéro, n'oubliez pas d'insérer un promoteur et une séquence de terminaison de transcription appropriés. Les séquences de promoteurs utilisent généralement des promoteurs inductibles, les promoteurs constitutifs provoqueront une expression prématurée et une accumulation de protéines étrangères, ce qui n'est pas propice à la prolifération de l'hôte.


3. Sélection d'hôte


Les hôtes communs sont E. coli, les cellules de mammifères, les levures et les insectes. Pour E. coli, la souche la plus appropriée pour l'expression hétérologue est BL21 et ses souches dérivées, mais elle doit encore être sélectionnée en fonction des éléments de transcription et de traduction sélectionnés dans le vecteur.


Le gène de la protéase endogène dans BL21 est manquant, c'est donc une souche appropriée pour l'expression de protéines étrangères, mais elle n'a pas d'ARN polymérase T7, donc elle ne peut pas être utilisée pour l'expression de protéines contenant le promoteur T7; BL21 (DE3), dans BL21 Sur la base de l'intégration du génome du phage T7, il convient aux systèmes d'expression T7, tels que la série pET; BL21 (DE3) PLyS, basés sur BL21 (DE3), avec le gène lysozyme T7, qui peut contrôler plus strictement l'expression de la polymérase T7.


Il est à noter qu'en raison de l'existence de gènes tels que l'endonucléase (endA1) recombinase (recA1), le plasmide n'est pas aussi stable dans la série de souches BL21, et peut être intégré dans le génome, perte, mutation, etc., alors construisez un bon vecteur Il doit encore être stocké dans des souches telles que DH5α.


4. Optimisation des conditions de culture


En prenant le système d'expression d'E. Coli comme exemple, le milieu LB peut être utilisé à la fois pour la réanimation et la culture de graines.

Il est préférable d'utiliser un milieu avec une teneur en acides aminés plus élevée mais une source de sucre plus faible pendant la phase de fermentation, comme le milieu TB pour favoriser la synthèse et l'accumulation des protéines.

Si un promoteur inductible est utilisé, un inducteur tel que l'IPTG doit être ajouté lorsque les bactéries se développent jusqu'à la phase de croissance logarithmique tardive.

Après avoir ajouté l'inducteur, la température de culture doit être abaissée à 16-30 ° C. Plus la température de culture est basse, plus l'accumulation de protéines est lente et moins elle est susceptible de produire des corps d'inclusion.


5. Sélection du matériau de la colonne de purification

Chaque étiquette a un matériau de colonne de purification correspondant. GST-tag utilise du gel de glutathion, MBP-tag utilise de la résine de polysaccharide, CBD-tag utilise de la résine de chitine et His-tag utilise des charges couplées à des ions métalliques divalents, dont le plus courant est couplé au nickel ionique, communément appelé colonne de nickel.

Le garnissage de colonne de nickel NEBExpress (S1428S) a été récemment lancé en novembre 2019. Il existe également une forme de colonne de rotation pré-remplie (S1427S / L), qui est plus adaptée à la purification de petites protéines lors de l'étape de criblage. La purification de 1 mg de protéine marquée His ne prend que 15 minutes.

Chaque garniture de colonne de nickel de 1 ml peut purifier ≥ 10 mg de protéines marquées à l'histidine;

Liaison hautement spécifique aux protéines avec étiquette His, pureté> 95% après séparation et purification;

La forte liaison des ions nickel le rend extrêmement résistant à l'EDTA et aux agents réducteurs, et est compatible avec les réactifs de lyse cellulaire à base de détergent courants.