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Méthode de conception d'amorce de clonage par PCR

Temps de mise à jour : 2020-08-17

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Méthode de conception d'amorce de clonage par PCR

Le clonage par PCR est une technologie de biologie moléculaire qui amplifie et étend des fragments d'ADN spécifiques, et est largement utilisée en biologie moléculaire et dans les domaines connexes.

Parmi eux, l'amorce de clonage PCR est un facteur important dans le processus de réaction d'expansion PCR. Par conséquent, avant que l'expérience de clonage PCR ne soit officiellement lancée, il est nécessaire de maîtriser la méthode de conception d'amorce de clonage PCR correcte.


Processus de conception d'amorce de clonage PCR:


Obtenir la séquence de fragments d'extension de PCR: Dans le premier cas, développez en fonction des fragments connus et vous devez concevoir des amorces d'expansion de PCR via la recherche NCBI des séquences de gènes; dans l'autre cas, développez des fragments de gène inconnus, vous devez rechercher des séquences conservatrices d'espèces apparentées, basées sur des séquences conservatrices ADN ou ARN comme modèle pour concevoir des amorces.


Par exemple, le logiciel de conception d'amorce Prime Premier 5.0 est puissant et facile à utiliser. Il peut comparer et évaluer de manière exhaustive la conception des amorces. C'est l'un des logiciels les plus couramment utilisés pour la conception d'amorces.


Vérification du test d'extension par PCR: l'amplification par PCR peut être effectuée une fois la synthèse des amorces terminée, et l'exactitude des amorces de clonage par PCR peut être prédite en fonction de la longueur du produit amplifié par électrophorèse sur gel.


Précautions pour la conception d'amorce de clonage PCR:


La longueur de l'amorce est essentiellement maintenue entre 18 et 24 pb. Si la longueur de la séquence d'amorces est trop courte, elle peut s'étendre et affecter la vitesse d'expansion du clonage par PCR; si la longueur de l'amorce est trop longue, la réduction de l'amorce ne peut pas être augmentée, mais la séquence trop longue provoquera des mésappariements et réduira la vitesse d'expansion du clonage par PCR.


Par conséquent, la valeur Tm appropriée est de 55 à 80 ° C, et la différence de température d'initiation entre les amorces en amont et en aval doit être dans les 10 ° C.

Par conséquent, la teneur en GC de l'extension affectera la température de fusion de l'oligonucléotide pendant le processus de clonage par PCR, c'est-à-dire la valeur Tm.

Généralement, la teneur en GC de l'extension est comprise entre 40% et 60%, et la différence de teneur en GC entre les amorces en amont et en aval est de 20%, ce qui peut augmenter la teneur en amorce.



Si cela se produit, des discordances peuvent se produire pendant le processus de PCR, ce qui affectera la précision de l'amplification par PCR.

Empêcher le simple brin de l'amorce d'amplification de former une structure secondaire pendant le processus de clonage par PCR et inhiber le processus d'expansion de la PCR.


La plate-forme de synthèse de gènes de Generalbiosystems utilise une technologie de clonage brevetée pour aider les clients à cloner le gène cible à n'importe quelle position désignée sur le vecteur souhaité sans s'appuyer sur des sites de restriction vectorielle pour répondre à divers plans de conception de clonage pour les clients.