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Méthode de clonage par PCR | Avantage | Désavantages

Temps de mise à jour : 2020-08-04

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Méthode de clonage par PCR | Avantage | Désavantages

La différence entre le clonage PCR et le clonage traditionnel est qu'il peut amplifier des fragments d'ADN cibles, voire des vecteurs, par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les ligaturer ensemble sans utiliser d'enzymes de restriction.

Le clonage par PCR est une méthode rapide de clonage de gènes, généralement utilisée pour les projets qui nécessitent un débit plus élevé, et le débit de ces projets est plus élevé que celui des méthodes de clonage traditionnelles. Il permet le clonage de fragments d'ADN qui ne sont pas disponibles en grande quantité.


Habituellement, une réaction de PCR est effectuée pour amplifier la séquence d'intérêt, puis elle est connectée au vecteur par une ligature en surplomb à bouts francs ou à une seule base avant la transformation.

Le clonage PCR précoce de l'ADN polymérase Taq est souvent utilisé pour amplifier le gène.

Il en résulte un produit de PCR dans lequel un seul résidu d'adénine (A) est ajouté à l'extrémité 3 'du produit de PCR, qui est indépendante de la matrice, par l'action normale de la polymérase.

Ces produits "A-tail" sont ensuite ligaturés à un vecteur T-tail complémentaire en utilisant l'ADN ligase T4, puis transformés.


Maintenant, les ADN polymérases haute fidélité sont également couramment utilisées pour amplifier des séquences qui ne contiennent pas de produits de PCR d'extension 3 '.

Le fragment aux extrémités franches est ligaturé au vecteur plasmidique par une réaction de ligature typique ou par l'action d'un vecteur "activé" contenant une enzyme ligaturée de manière covalente (habituellement la topoisomérase I), ce qui facilite la ligature du vecteur: insert.

Certains systèmes de clonage par PCR contiennent des vecteurs «suicide» modifiés qui comprennent un gène toxique auquel le produit de la PCR doit être ligaturé avec succès pour permettre la propagation de souches qui absorbent la molécule recombinante pendant le processus de transformation.


Un inconvénient typique partagé par de nombreuses méthodes de clonage par PCR est que des vecteurs spéciaux doivent être utilisés.

Ces vecteurs sont généralement vendus par des fournisseurs (tels que NEB) dans des formats linéarisés prêts à l'emploi et peuvent ajouter des coûts importants au coût total du clonage.

De même, l'utilisation des vecteurs spe spéci- limite les choix des chercheurs pour la résistance aux antibiotiques, l' identité du promoteur, les partenaires de fusion et d' autres éléments régulateurs.

Avantage du clonage par PCR :


✧ Efficace, avec un transporteur dédié
Convient pour un débit élevé

Inconvénients du clonage par PCR :

Sélection de vecteurs limitée
coût plus élevé
Manque de contrôle séquentiel à la jonction
✧ Le clonage multi-fragments n'est pas facile
✧ Le clonage directionnel est difficile