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Comment gérer les corps d'inclusion dans les expériences d'expression de protéines?

Temps de mise à jour : 2021-01-05

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Comment gérer les corps d'inclusion dans les expériences d'expression de protéines?
Quels problèmes l'expression des protéines rencontre-t-elle souvent? Les organismes d'inclusion en font partie. Pour la plupart des expériences, les corps d'inclusion sont comme des côtes de poulet. Cependant, c'est souvent un problème qui doit être traité dans le processus d'expression des protéines procaryotes.

Le meilleur moyen est bien sûr d'éviter l'apparition de corps d'inclusion, mais il existe également de nombreuses protéines qui ne peuvent être obtenues sous forme surnageante lors de l'expression procaryote. À ce stade, la renaturation des corps d'inclusion en protéines actives devient le meilleur choix.
怎样 处理 蛋白 表达 实验 中 出现 的 包涵体?

Séparation et lavage des corps d'inclusion

Les corps d'inclusion ont une densité plus élevée que les autres composants, ils peuvent donc être collectés par centrifugation. Après avoir traité les bactéries avec du lysozyme, les cellules sont généralement perturbées par l'homogénéisation à haute pression.

Étant donné que les liposomes et les membranes cellulaires partiellement cassées et les protéines membranaires peuvent adhérer aux corps d'inclusion, les corps d'inclusion doivent être lavés avant dénaturation et dissolution, généralement avec une faible concentration de dénaturant tel que 0,5-1 M de chlorhydrate de guanidine ou d'urée.

De plus, vous pouvez également laver avec un détergent doux 1% TritonX-100 ou du désoxycholate de sodium pour éliminer les fragments de membrane et les protéines membranaires.

Dégénérescence du corps d'inclusion

Remettre en suspension et incuber les corps d'inclusion dans un tampon contenant un dénaturant et un agent réducteur (généralement 20 mM de DTT ou de β-mercaptoéthanol). L'ajout d'un agent réducteur peut maintenir Cys dans un état réduit. Il peut également rompre les liaisons disulfure dans les protéines.

La température d'incubation pendant le processus de dénaturation est habituellement maintenue à 30 ° C pour favoriser la dissolution des protéines. L'optimisation de diverses conditions dans ce processus est déterminée par les caractéristiques de la protéine spécifique, et une expérience à petite échelle peut être effectuée pour trouver les meilleures conditions de dissolution.
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Comment gérer les corps d'inclusion dans les expériences d'expression de protéines?

Voici les conditions expérimentales de dénaturation en général:

Une fois la dénaturation des corps d'inclusion terminée, une centrifugation est nécessaire pour éliminer les insolubles restants, sinon les insolubles restants peuvent provoquer une agrégation de protéines et une précipitation pendant le processus de repliement de la protéine cible. Il est préférable d'utiliser l'ultracentrifugation (100 000 g, 30 minutes) pour la centrifugation.

Repliement de la protéine soluble

La première étape de la renaturation consiste à éliminer le dénaturant. Les principaux facteurs défavorables dans le processus de renaturation des protéines sont le mauvais repliement et la précipitation des protéines.

Afin d'empêcher la précipitation des protéines pendant le processus de renaturation, il est nécessaire de réduire la concentration en protéines et la plage de concentrations en protéines est contrôlée entre 10 et 100 mg / ml.

Pour différentes protéines, les conditions de renaturation doivent être optimisées. Les facteurs importants du processus de renaturation sont les suivants:
  • Composition du tampon (pH, concentration);
  • Température;
  • Additifs (généralement plusieurs additifs sont utilisés ensemble).

L'agent dénaturant et l'agent réducteur sont éliminés, et la molécule de protéine dénaturée est dotée d'un environnement de repliement et de récupération d'activité correct, et la protéine active naturelle peut être obtenue. Les méthodes de renaturation les plus couramment utilisées sont la dialyse, la dilution, la chromatographie, etc.

La dialyse est la méthode la plus couramment utilisée dans les laboratoires, mais elle prend beaucoup de temps et forme facilement des agrégats de protéines inactifs. MaedaY a conçu une méthode de dialyse lente, utilisant une solution d'urée 8mol / L comme dialysat de départ, puis augmentant progressivement la solution sans urée pour réduire la concentration de dénaturant.

Dans cette méthode, la concentration de dénaturant diminue plus de manière continue et lente, et il n'y a pas de mutation dans la concentration de dénaturant dans la méthode de dilution, ce qui peut aider à réduire la précipitation lors de la renaturation de certaines protéines et augmenter le rendement en protéines actives. Avec cette méthode, le taux de renaturation des IgG atteint 70% à 1 mg / ml.

La dilution est la méthode de repliement la plus simple et la plus efficace. Après dilution, lorsque le dénaturant et l'agent réducteur tombent à une certaine concentration, les molécules de protéines commencent à se replier, mais la quantité de liquide traité est importante, ce qui n'est pas propice à une amplification industrielle. Les méthodes de dilution actuelles comprennent principalement une dilution unique, une dilution segmentée et une dilution en série.

La renaturation chromatographique est une méthode de renaturation qui a été étudiée plus fréquemment. Des colonnes chromatographiques sont utilisées pour éliminer les dénaturants. Les méthodes chromatographiques couramment utilisées comprennent les tamis moléculaires, la chromatographie d'échange d'ions et la chromatographie d'affinité.

Lorsque la protéine migre lentement dans la colonne, le dénaturant peut être éliminé, ou la protéine est liée à la colonne de chromatographie et séparée du dénaturant. La renaturation chromatographique est généralement utilisée pour la renaturation des protéines à grande échelle, et la concentration en protéines de renaturation va jusqu'à mg / ml.


Si vous rencontrez trop de corps d'inclusion dans l'expérience, vous pouvez aussi bien essayer les méthodes ci-dessus. Si vous ne pouvez toujours pas le résoudre, vous pouvez également envisager Generalbiosystems pour vous aider. Nous sommes une entreprise professionnelle de préparation de protéines recombinantes.