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Méthodes et précautions pour la purification des protéines

Temps de mise à jour : 2020-10-26

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Méthodes et précautions pour la purification des protéines
La première étape de la recherche sur les protéines consiste à séparer et à purifier la protéine cible d'un mélange complexe de macromolécules pour obtenir une cible de haute pureté avec une activité biologique. Par conséquent, des techniques et des méthodes efficaces de purification des protéines sont l'un des fondements et des clés importants de la recherche sur les protéines.

Méthode d'extraction et de purification des protéines

Extraction de protéines (y compris les enzymes)

La plupart des protéines sont solubles dans l'eau, le sel dilué, l'acide dilué ou les solutions alcalines, et quelques protéines liées aux lipides sont solubles dans les solvants organiques tels que l'éthanol, l'acétone, le butanol, etc. Par conséquent, différents solvants peuvent être utilisés pour l'extraction, la séparation et purification. Protéines et enzymes.

(1) Méthode d'extraction en solution aqueuse

La solution aqueuse de sel dilué et de système tampon a une bonne stabilité et une solubilité élevée pour les protéines. C'est le solvant le plus couramment utilisé pour l'extraction des protéines.

La quantité habituelle est de 1 à 5 fois le volume de la matière première. L'extraction nécessite une agitation uniforme pour faciliter la dissolution des protéines. La température d'extraction dépend de la nature des principes actifs.


D'une part, la solubilité de la plupart des protéines augmente à mesure que la température augmente. Par conséquent, des températures plus élevées sont propices à la dissolution et raccourcissent le temps d'extraction.

Mais d'un autre côté, l'augmentation de la température va dénaturer et inactiver la protéine. Par conséquent, sur la base de ce point, l'extraction des protéines et des enzymes utilise généralement un fonctionnement à basse température (inférieure à 5 degrés).

Afin d'éviter la dégradation lors de l'extraction des protéines, des inhibiteurs d'enzymes protéolytiques (tels que le diisopropyl fluorophosphate, l'acide iodoacétique, etc.) peuvent être ajoutés.



(2) Méthode d'extraction par solvant organique

Certaines protéines et enzymes qui sont plus fermement liées aux lipides ou qui ont des chaînes latérales plus non polaires dans la molécule sont insolubles dans l'eau, diluent les solutions salines, diluent les acides ou diluent les alcalis.

Des solvants organiques tels que l'éthanol, l'acétone et le butanol peuvent être utilisés. Il a une certaine hydrophilie et une forte lipophilie. C'est une solution d'extraction de lipoprotéines idéale. Mais il doit fonctionner à basse température.


La méthode d'extraction au butanol est particulièrement supérieure pour extraire certaines protéines et enzymes étroitement liées aux lipides. L'un est que le butanol a une forte lipophilie, en particulier sa capacité à dissoudre les phospholipides; l'autre est que le butanol a à la fois un caractère hydrophile et se situe dans la plage de solubilité.

(Le degré est de 10%, 40 degrés est de 6,6%) ne provoquera pas de dénaturation et d'inactivation de l'enzyme. En outre, la méthode d'extraction au butanol a une large gamme d'options de pH et de température, et elle convient également aux matériaux animaux, végétaux et microbiens.


Précautions pour l'extraction et la purification des protéines:


Lors de la purification de tout type de protéine, vous devez toujours faire attention à maintenir sa stabilité et à protéger son activité. Il y a quelques précautions générales à garder à l'esprit. Ils incluent:

1. L'opération doit être placée sur de la glace ou dans une chambre froide dans la mesure du possible.

2. Ne soyez pas trop dilué, maintenez la concentration de protéines à μg / mL ~ mg / mL.

3. pH correct, sauf si une chromatographie focalisée est effectuée, la solution tampon utilisée doit éviter le même pH que le pi pour éviter la précipitation des protéines.

4. Utilisez des inhibiteurs de protéase pour empêcher la protéase de dégrader la protéine cible; lors de la purification de la protéine dans la cellule, ajoutez de la DNase pour dégrader l'ADN et empêcher l'ADN de contaminer la protéine.

5. Évitez la congélation et la décongélation répétées et l'agitation vigoureuse de l'échantillon pour éviter la dénaturation des protéines.

6. Les composants de la solution tampon imitent autant que possible l'environnement intracellulaire.

7. Ajouter 0,1 ~ 1 mmol / LDTT (dithiothréitol) (ou β-mercaptoéthanol) à la solution tampon pour éviter l'oxydation des protéines.

8. Ajouter 1 ~ 10 mmol / agent chélatant de métal LEDTA pour empêcher les métaux lourds d'endommager la protéine cible.

9. Utilisez une solution stérilisante pour empêcher la croissance de micro-organismes.

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