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Méthodes de synthèse des gènes

Temps de mise à jour : 2020-08-25

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Méthodes de synthèse des gènes

Les méthodes de synthèse génique comprennent principalement la PCR d' assemblage, la PCR d' extension par chevauchement, la méthode TBIO et la méthode PTDS.


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Avant la synthèse des gènes, afin de permettre aux gènes de bien s'exprimer dans différents systèmes d'expression biologique, les chercheurs effectuent généralement une optimisation des codons sur les gènes.

Il existe 64 codes génétiques, mais la plupart des organismes ont tendance à utiliser certains de ces codons. Ceux qui sont utilisés le plus fréquemment sont appelés codons optimaux, et ceux qui ne sont pas utilisés fréquemment sont appelés codons rares ou peu utilisés.


En fait, chaque organisme utilisé pour l'expression ou la production de protéines (y compris E. coli, la levure, les cellules de mammifères, les cellules végétales et les cellules d'insectes) présente un certain degré de préférence de codon.

Par conséquent, l'expression de protéines recombinantes peut être affectée par des codons. L'impact de l'utilisation des enfants (en particulier dans les systèmes d'expression hétérologues).


Sans changer sa protéine codante, le processus de changement du gène codant d'une protéine, d'élimination des codons rares et d'optimisation raisonnable de sa structure secondaire d'ARNm, de sa teneur en GC, etc. s'appelle l'optimisation des codons.

Le principe de l'optimisation des codons est de sélectionner différents codons pour chaque acide aminé dans la séquence protéique cible en fonction de la préférence de codon du système d'expression à utiliser pour effectuer la combinaison de la séquence entière et trouver la meilleure.


1. Synthèse des amorces
Une fois que les chercheurs ont déterminé la séquence du gène synthétique selon leurs propres souhaits, puisqu'il n'y a pas de matrice, ils doivent d'abord concevoir et synthétiser des amorces basées sur l'ADN double brin à synthétiser.
À l'heure actuelle, la synthèse d'amorces adopte essentiellement la méthode du triester de phosphoramidite en phase solide. Le procédé au triester de phosphoramidite pour synthétiser des fragments d'ADN a les caractéristiques d'une efficacité élevée, d'un couplage rapide et de réactifs initiaux relativement stables.
2. Amplification par PCR avec des amorces comme modèles
Une fois les amorces synthétisées, les amorces servent de modèles pour l'amplification par PCR. Le principe de base de la technologie PCR est similaire au processus de réplication naturelle de l'ADN, et sa spécificité repose sur des amorces oligonucléotidiques complémentaires des deux extrémités de la séquence cible.
3. Transformation de connexion, inspection et test des bactéries
Grâce à la réaction de PCR, l'ADN double brin dont nous avons besoin peut être amplifié. Mais la stabilité du produit de PCR est faible, nous devons le ligaturer au plasmide, le transformer en un état compétent et l'étaler sur une plaque pendant la nuit. Les clones positifs peuvent être prélevés dans l'assiette le lendemain matin. Les clones choisis doivent être vérifiés à nouveau par PCR sur colonie pour vérifier s'il y a une insertion de gène pleine longueur. La PCR est réalisée avec les amorces tête et queue. S'il y a un produit, cela indique qu'il existe un gène cible. Les clones vérifiés sont transformés en bactéries de culture en tube à essai, après quoi les plasmides sont extraits, purifiés et envoyés pour séquençage.
4. Séquençage de première génération
Actuellement, nous utilisons le séquençage de première génération, également appelé séquençage sanger. Le séquençage de Sanger utilise une ADN polymérase pour étendre une amorce liée à une matrice d'une séquence en attente jusqu'à ce qu'un nucléotide de terminaison de chaîne soit incorporé. Chaque détermination de séquence consiste en un ensemble de quatre réactions distinctes, chacune contenant les quatre désoxynucléotides triphosphates (dNTP), mélangés avec une quantité limitée d'un didésoxynucléotide triphosphate (ddNTP) différent.
5. Vérification QC

Le résultat du séquençage est comparé au gène cible et la vérification de la digestion par l'enzyme QC est effectuée en même temps. Si le résultat du séquençage et le résultat de la vérification de la digestion sont corrects, la synthèse du gène cible est terminée. Selon les étapes ci-dessus, une séquence génique d'environ 800 pb peut être synthétisée en 5 jours dans des conditions douces.