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Quatre approches de sous-clonage

Temps de mise à jour : 2020-08-06

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Quatre approches de sous-clonage
Du point de vue d'une entreprise spécialisée dans les services de sous-clonage , generalbiosystems vous apportera des réponses aux approches utilisées par le sous-clonage.

✦ Digestion par restriction

Les endonucléases de limitation (RE), également appelées enzymes de restriction, sont des protéines qui identifient des séries d'ADN courtes et détaillées (généralement palindromiques). Les RE de type II clivent l'ADN double brin (ADNdb) sur certains sites Web à l'intérieur ou à côté de leurs séquences de reconnaissance.

Beaucoup d'enzymes de limitation ne réduiront certainement pas l'ADN qui est méthylé sur un ou les deux poils du site de reconnaissance, bien que certains appellent à la méthylation du substrat.


Digestion partielle par restriction

Contrôle de la fréquence de coupure dans la digestion par restriction

La visibilité d'un site Web de reconnaissance de limitation dans l'insert ainsi que la région de clonage multiple n'empêche pas nécessairement l'utilisation de ce site Web de restriction dans une technique de sous-clonage. Dans des conditions d'absorption de restriction typiques, l'enzyme est en excès pour s'assurer que tous les sites de reconnaissance dans le plasmide peuvent être clivés.

Vous pouvez manipuler les conditions de résumé de contraintes de telle sorte que vous ne digérerez certainement qu'une partie des sites Web.

De nombreuses approches ont en fait été utilisées pour faire des digestions partielles: diminution du niveau de température de réaction, utilisation d'une barrière non optimale et abaissement des systèmes d'enzymes.


Vecteurs de déphosphorylation pour limiter l'auto-ligature

L'arrêt de l'auto-ligature du vecteur est essentiel pour réduire l'historique de sous-clonage. L'efficacité de la ligature du plasmide à lui-même est bien meilleure que la ligature d'un morceau séparé d'ADN directement dans le vecteur et est la réponse préférée. Se débarrasser des phosphates 5 'du vecteur linéarisé arrêtera la T4 DNA Ligase de recirculariser le vecteur. La phosphatase alcaline intestinale de veau est l'enzyme intemporelle de la déphosphorylation vectorielle.

L'enzyme peut être utilisée sur des extrémités en retrait de 5 '(c'est-à-dire qu'elle provient d'une enzyme laissant un surplomb de 3'), des surplombs de 5 'ainsi que des extrémités franches.

Après la déphosphorylation, l'enzyme doit être éliminée soit par purification directe ou électrophorèse sur gel et également par isolement sur gel avec des systèmes de filtration d'ADN comme le Gel et le système de nettoyage PCR.

La phosphatase alcaline de crevette peut être utilisée à la place de la phosphatase alcaline du tractus intestinal d'os de veau et offre également l'avantage d'une simple dénaturation à la chaleur pour suspendre l'enzyme sans nécessiter une filtration supplémentaire.


Purifier le vecteur et insérer

La filtration de l'insert ainsi que le vecteur de localisation sont absolument essentiels pour réussir dans les applications de sous-clonage.

Il y a des années, chaque étape nécessitait des extractions au phénol: chloroforme auxquelles adhéraient les précipitations d'éthanol pour éliminer les enzymes telles que la phosphatase alcaline digestive du veau des contrôles de vecteurs chimiques.

Les systèmes de nettoyage des acides nucléiques à base de guanidine ont considérablement simplifié l'élimination des enzymes.

Les approches d'isolement sur gel ont encore amélioré l'efficacité du sous-clonage en séparant les catalyseurs voulus des réactifs indésirables.