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Facteurs affectant l'expression des protéines

Temps de mise à jour : 2020-10-27

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Facteurs affectant l'expression des protéines

Lors des expériences d' expression de protéines , l'expérience a parfois l'impression qu'il n'y a pas de problème avec la méthode d'expérience de référence et la séquence du gène de la protéine clonée, et l'électrophorèse des protéines n'a pas de résultats.

Les raisons pour lesquelles la protéine n'est pas exprimée sont résumées.


1. Mauvaise construction du vecteur. Ce n'est pas rare et de nombreux nouveaux cloneurs se trompent souvent sur le cadre de lecture. Par exemple, les vecteurs de la série pQE de Qiagen ont souvent une différence d'une ou deux bases dans leurs sites de clonage; en outre, certaines enzymes produisent des extrémités collantes et certaines enzymes produisent des extrémités franches, ce qui peut facilement conduire à des erreurs de cadre de lecture et donc ne pas s'exprimer.

2. Mauvaise sélection des bactéries hôtes. Différentes bactéries hôtes ont des génotypes différents.

Pour certains vecteurs spécialement modifiés, ou vecteurs à usage spécial, ou vecteurs avec des promoteurs spéciaux, des bactéries hôtes appropriées doivent être sélectionnées pour l'expression.


Par conséquent, lorsque votre protéine n'est pas exprimée, vous pouvez envisager de remplacer la bactérie hôte.


3. La fréquence d'utilisation des codons est faible. Certains gènes eux-mêmes contiennent de nombreux codons rares, en particulier les codons rares à moins de 15 bases après le codon de départ, qui ont une influence très importante sur l'expression des protéines. Les codons optimisés semblent avoir un bon effet sur l'expression procaryote, mais n'ont pas vu un bon effet sur les systèmes d'expression eucaryotes.

4. Le plasmide est instable ou perdu. Les systèmes pET sont généralement relativement stables. Mais lorsque vous choisissez un vecteur résistant à l'ampicilline, il peut être possible de produire de la β-galactosidase qui dégrade l'antibiotique et perd le plasmide.

Une autre situation est l'expression de la protéine de toxine recombinante, qui est également toxique pour les cellules hôtes, provoquant une perte de plasmide. Cette situation est plus courante dans les systèmes d'expression eucaryotes.


5. La protéase dégrade la protéine. Cette situation est souvent causée par la séquence N- ou C-terminale de la protéine recombinante elle-même. Lorsque le N-terminal de la protéine est Arg, Leu, Lys, Phe, Trp ou Tyr, ces acides aminés sont sujets à la dégradation de la protéase, qui est la règle N-terminale.

Lorsque le N-terminal est Met, E. coli peut voler ce Met tranquillement, en particulier lorsque Met est suivi par un acide aminé avec une petite chaîne latérale.

La présence d'acides aminés non polaires à l'extrémité C-terminale peut également facilement conduire à une dégradation des protéines. Les 5 derniers acides aminés à l'extrémité C-terminale sont polaires ou chargés et ne se dégradent pas facilement.


6. Site de démarrage de la traduction secondaire. C'est le cas lorsque votre séquence contient exactement la même séquence que le site de liaison au ribosome.

Le ribosome trouvera ce site et commencera à se traduire, provoquant la troncature de votre protéine, et des fragments de la taille attendue ne pourront pas être vus pendant l'électrophorèse.


7. Séquence SD. La distance entre la séquence SD et la séquence du codon de départ (80% est AUG et GUG) a également un impact très important sur l'efficacité de l'expression des protéines.

La composition de la séquence SD elle-même affecte également l'efficacité de la traduction. Parfois, afin de réduire la production de corps d'inclusion, la séquence SD est spécialement modifiée!


8. La structure secondaire de l'ARNm. Avant le clonage, vous devez voir s'il existe une séquence complémentaire du site de liaison au ribosome et / ou du site de début de traduction dans votre séquence.

9. Résiliation inattendue. Cette situation est observée dans l'amplification par PCR des séquences. Par exemple, il mute le TAC au milieu de la séquence en TAA, ce qui freine la traduction de vos protéines.

Par conséquent, le séquençage doit être effectué avant l'expression pour éviter cette situation.


10. Terminateur de transcription. L'existence d'un terminateur de transcription peut favoriser l'expression des protéines; mais quand il fait défaut, il provoquera une "lecture" et une lecture sans fin.

Ce n'est pas un problème dans le système pET car il a un gène marqueur sélectif dans la direction opposée du gène cible.

Si votre gène cible se trouve dans la même direction que ce gène marqueur, alors vous devez voir s'il existe un terminateur de transcription après votre gène cible.


11. L'instabilité de l'ARNm. L'ARNm du gène cible s'accumule souvent dans la cellule. Mais l'ARNm des bactéries coliformes est extrêmement instable.

Si une séquence structurale stable est insérée dans la région 5 'non traduite et le terminateur 3'-rho-indépendant de l'ARNm, la stabilité de l'ARNm peut être favorisée.

Surtout si l'extrémité 5 'a une structure en épingle à cheveux sans faire saillie, elle peut rendre l'ARNm inanimé dans le cytoplasme.


12. La faisabilité de la méthode de détection. Parfois, la protéine est effectivement exprimée, mais le niveau d'expression est extrêmement faible, ou il est si proche de la bande diverse que vous pensez à tort que la protéine n'est pas exprimée.

À ce stade, il ne faut pas oublier les deux règles d'or des expériences biologiques: le contrôle et la répétition.



En résumé, tout matériel expérimental est très important. La construction correcte des vecteurs d'expression de protéines est la base des expériences d'expression de protéines.

Par conséquent, l'exactitude des vecteurs d'expression des protéines doit être garantie. Une bactérie hôte appropriée est également la base des expériences d'expression de protéines.


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