Accueil > Nouvelles > Nouvelles de l'industrie

Stratégies de sous-clonage courantes

Temps de mise à jour : 2020-08-05

La source :

Vues: 44

Stratégies de sous-clonage courantes

Pour étudier la fonctionnalité souhaitée d'un insert, il est nécessaire de les transférer d'un vecteur à un autre, cette procédure de transfert est connue sous le nom de sous- clonage . Étapes du sous- clonage:


  • Libérez et purifiez votre insert du vecteur parent
  • Ligatez cet insert dans un vecteur de destination préparé
  • Transformez cette réaction de ligature en cellules bactériennes compétentes
  • Filtrer les cellules transformées pour l'insert

Différentes stratégies de sous-clonage :

Pour tout travail de sous-clonage, des connaissances préalables sur le vecteur et l'insert sont nécessaires.

Les informations sur les sites RE disponibles dans les régions de clonage multiple du vecteur parent, les sites RE disponibles dans l'insert (en cas de digestion en insert). Également des informations sur la récurrence des sites RE dans les régions de clonage multiple de vecteur de destination et les sites RE dans l'insert.

En fonction de la combinaison différente de ces sites, la stratégie de sous-clonage à utiliser est décidée.


✦ Sites de restriction communs

Un processus de sous-clonage simple peut être utilisé si les régions de clonage multiples du vecteur parent et de destination contiennent des sites de restriction communs et qu'aucun de ces sites de restriction n'apparaît dans votre insert.

Les vecteurs parent et de destination sont digérés en utilisant les deux mêmes enzymes. Ceci est suivi par la déphosphorylation du vecteur de destination. Séparez à la fois l'insert et le vecteur déphosphorylé à l'aide d'un gel d'agarose. Purifiez ensuite le vecteur d'insertion en utilisant n'importe quel système de purification d'ADN. Enfin, ces vecteurs et inserts sont ligaturés.


Déplacement d'inserts avec des sites de restriction compatibles

  Il existe des cas où les sites de restriction dans les régions de clonage multiples du vecteur parent et de destination ne sont pas communs mais peuvent être compatibles. Les sites de restriction compatibles ont la même séquence de surplomb et peuvent être ligaturés ensemble.

Après la ligature, les sites régénérés ne ressemblent pas aux deux sites de restriction dans les régions de clonage multiples du vecteur parent et de destination. Une fois les enzymes nécessaires à la ligature et à la restriction identifiées. Cette stratégie de clonage devient également simple.


Déplacement d'inserts avec un seul site commun


La combinaison de sites de restriction communs conduit à la possibilité d'une seule correspondance sur un côté de votre insert. Le problème doit être traité de l'autre côté de l'encart. Une coupe émoussée peut être utilisée.

L'action de l'ADN polymérase T4 peut émousser n'importe quel site de restriction. Digérer le vecteur parent et émousser ce site avec l'ADN polymérase T4. Passer les produits sur un gel, purifier et procéder à la digestion par enzyme de restriction terminale commune ou compatible.

La plupart des vecteurs ont au moins un site de restriction à extrémités franches qui peut accepter l'extrémité émoussée nouvellement créée à partir de l'insert.

Si vous ne disposez pas d'un tel site ou si le site ne serait pas dans la bonne orientation, la même stratégie «couper-couper-couper» peut être appliquée à la destination.


Méthode d'extrémité émoussée

Le scénario final d'absence de site de restriction commun est commun ou compatible avec le vecteur parent ou de destination.

Dans ce scénario, la meilleure stratégie consiste à amplifier l'insert avec des sites de restriction dans les amorces pour assurer la compatibilité. Mais cette méthode a son propre ensemble de problèmes.

Il existe une possibilité de mutations. De plus, il y a beaucoup de difficultés dans la digestion des produits de PCR. Une autre stratégie peut être utilisée dans ce scénario. Découpez l'insert avec des enzymes.

Traitez avec l'ADN polymérase T4 pour émousser les surplombs de 5 'ou 3' et ligaturer dans le vecteur de destination ouvert avec un outil de coupe à bouts francs ou rendus francs par l'ADN polymérase T4. L'orientation de l'isert peut ne pas être conservée par cette méthode.