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Avantages des méthodes de purification des protéines

Temps de mise à jour : 2020-12-09

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Avantages des méthodes de purification des protéines

Qu'il s'agisse de recherche ou d'application de protéines, il est généralement nécessaire d'exprimer la protéine dans différents systèmes biologiques (tels que E. coli, levure, baculovirus d'insecte, système d'expression de protéine cellulaire de mammifère , etc.), puis de la séparer et de la purifier. Les laboratoires de recherche ont généralement besoin de purifier des microgrammes ou des milligrammes de protéines, tandis que l'industrie a besoin de purifier des milliers de grammes, voire des tonnes de protéines.


Mammalian cell protein

Par conséquent, la purification des protéines est très importante. Pendant le processus de purification, la contamination de l'hôte, la solubilité de l'échantillon, l'intégrité de la structure des protéines et l'activité biologique doivent être prises en compte. La purification des protéines peut être grossièrement divisée en trois étapes: la capture de l'échantillon, l'étape de purification intermédiaire et l'étape de purification fine.

Capture d'échantillon: traitement de séparation, concentration et stabilisation;

Purification modérée: pour éliminer l'acide nucléique et d'autres composants cellulaires, la méthode de précipitation au sulfate d'ammonium peut être utilisée;

Purification fine: distinguer la protéine cible des autres protéines de taille et de propriétés physiques et chimiques similaires. Les méthodes courantes comprennent la chromatographie par filtration sur gel, la chromatographie d'échange d'ions et la chromatographie d'affinité.

Guide de purification des protéines:


1. Objectifs clairs, éviter la sur-purification ou une purification insuffisante;
2. Identifier les caractéristiques de l'échantillon et les principales impuretés, et sélectionner la méthode de purification appropriée;
La combinaison de la technologie de purification peut être rapidement déterminée en détectant la fenêtre de stabilité des protéines (telle que la valeur du pH, la force ionique) et les données de base sur les protéines (telles que la taille des protéines, le point isoélectrique pl, l'hydrophobicité, la solubilité, etc.).

3. Il peut détecter rapidement le taux de récupération, l'activité et les impuretés de la protéine;

4. Minimisez les étapes pour éviter une perte excessive d'échantillons et une réduction excessive de l'activité;

5. Retirez la protéase et les autres impuretés susceptibles d'endommager l'échantillon dès que possible;

6. Minimisez l'utilisation d'additifs, sinon des étapes supplémentaires peuvent être nécessaires pour éliminer les additifs.
Escherichia coli expression system

Avantages de 6 méthodes de purification des protéines :

En raison des différentes propriétés des échantillons et des protéines, et des impuretés qu'ils contiennent, différentes stratégies de purification des protéines sont nécessaires.

Il existe actuellement six méthodes de purification des protéines: chromatographie par filtration sur gel, chromatographie d'échange d'ions, purification d'étiquettes, chromatographie d'affinité, chromatographie d'interaction hydrophobe, électrophorèse, etc. D'autres méthodes peuvent également être utilisées pour la purification des protéines, telles que l'utilisation de la stabilité thermique, la stabilité protéolytique et la solubilité de la protéine pour purifier la protéine.


1 Chromatographie par filtration sur gel

La chromatographie par filtration sur gel est une méthode efficace de séparation et de purification des protéines qui sépare les mélanges de protéines en fonction des différences de taille moléculaire.

Lorsque la solution protéique passe à travers une colonne de chromatographie par filtration sur gel contenant des particules compactées, parce que différentes protéines ont des tailles moléculaires différentes, leur capacité à se diffuser en particules d'une taille et d'une taille de pores spécifiques est également différente.

Les grosses protéines sont éluées en premier et le poids moléculaire est plus petit. , Le plus tard l'élution, de manière à atteindre l'objectif de la séparation et de la purification des protéines. D'une manière générale, plus la colonne de chromatographie par filtration sur gel est fine et longue, meilleur est l'effet de purification.


Cette technologie présente de nombreux avantages: elle est douce, l'échantillon n'est pas facilement dénaturé, elle n'a pratiquement aucun effet sur les protéines, elle a une bonne répétabilité, n'utilise pas de solvants organiques et a un taux de récupération élevé.

Cette méthode peut être utilisée pour la purification des protéines, la détermination du poids moléculaire et de sa plage de distribution, le remplacement du tampon, le dessalage, etc.


2 Chromatographie d'échange d'ions

La chromatographie par échange d'ions est une technique de séparation et de purification des protéines basée sur le type, la quantité et la distribution des charges à la surface de la protéine. Dans certaines conditions, les protéines chargées ponctuellement peuvent être associées à la colonne d'échange cationique / anionique et présentent une force de liaison. différence.

La liaison est réversible et est progressivement éluée dans l'ordre de liaison faible à forte pendant la chromatographie d'échange d'ions pour réaliser la séparation et la purification de la protéine.

Cette technologie présente les avantages d'une haute résolution, d'une capacité d'échange de protéines élevée, d'une application flexible, d'un principe de séparation clair, d'un fonctionnement simple, etc.

Il convient aux applications de laboratoire et à l'échelle industrielle, tandis que la filtration sur gel est difficile à réaliser pour des applications à l'échelle industrielle.


3 Chromatographie d'affinité

La chromatographie d'affinité utilise l'adsorption réversible spécifique de macromolécules biologiques et de ligands pour séparer et purifier les protéines. Cette méthode présente les avantages d'une spécificité élevée, de conditions douces, d'une vitesse rapide, d'une efficacité élevée, etc., et convient à la purification des protéines cibles à partir d'échantillons complexes et d'échantillons à haute teneur en impuretés.

L'adsorption spécifique de la protéine cible et du ligand peut être utilisée, ou la liaison spécifique entre le marqueur et le ligand peut être utilisée pour réaliser la séparation et la purification des protéines en ajoutant un marqueur.


4 Purification des étiquettes

La purification par étiquette utilise la technologie de recombinaison génétique pour ajouter quelques acides aminés supplémentaires à l'extrémité amino ou carboxyle de la protéine comme étiquette, ce qui facilite la séparation et la purification. Les balises courantes incluent GST, His, MBP, Strep-tag ™ II, etc.

Étiquette GST: Ajouter la glutathion S transférase (GST) à la séquence protéique, puis utiliser le glutathion Sepharose 4B pour la purification par affinité et la couper avec de la thrombine ou du facteur Xa. La méthode a des conditions douces et peut conserver l'antigénicité et la fonction de la protéine cible.

Son étiquette: L'histidine (His) est l'une des étiquettes courantes, car l'histidine est très petite et n'affecte guère la fonction, l'activité et la structure de la protéine cible. Ajoutez 6 à 10 histidines à l'acide aminé.

Dans des conditions dénaturantes, parce qu'il peut se lier étroitement à la colonne chélatante Ni2 +, il est élué avec de l'imidazole pour réaliser la séparation et la purification des protéines.


5 Chromatographie d'interaction hydrophobe

Le principe de la chromatographie d'interaction hydrophobe est le suivant: sous une force ionique élevée, la protéine du système salin-eau est partiellement désolvée et les groupes hydrophobes internes sont exposés.

Ces résidus peuvent avoir des interactions hydrophobes réversibles avec les fonctions hydrophobes du milieu. Lorsque la concentration ionique est réduite, le groupe hydrophobe de la protéine se cache, l'effet disparaît et l'élution est terminée.

En raison des différentes forces hydrophobes entre les différentes protéines et les ligands hydrophobes dans le milieu, la séparation et la purification des protéines peuvent être réalisées. Le procédé a un faible coût, peut conserver l'activité biologique de la protéine et est largement utilisé.


6 Électrophorèse

Le principe de l'électrophorèse pour séparer et purifier les protéines est que sous l'action d'un champ électrique, les particules colloïdales en pointillés se déplacent vers l'électrode avec des propriétés électriques opposées, et plus la molécule est grosse, plus la vitesse de déplacement est lente.

SDS-PAGE peut être utilisé pour la séparation et la purification de protéines. La protéine peut être développée par des agents de coloration. L'avantage est qu'il est facile à utiliser, économique et intuitif; l'inconvénient est qu'il ne peut pas être utilisé à grande échelle.