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8 conditions pour que les micro-organismes expriment les protéines

Temps de mise à jour : 2020-09-27

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8 conditions pour que les micro-organismes expriment les protéines

L'expression des protéines dans les micro-organismes est une technologie de base en biotechnologie. Il est relativement facile d'exprimer la protéine dans un hôte similaire à la source de la protéine cible.

Cependant, la plupart du temps, nous devons exprimer la protéine dans un hôte différent de la source de la protéine, comme l'expression de protéines eucaryotes dans des cellules procaryotes, ce qui est généralement difficile.


Ici, GeneralBiosystems partage avec vous plusieurs outils qui aident à atteindre l'expression des protéines à travers les systèmes.

1. Optimisation des codons
L'optimisation des codons consiste à introduire des codons que le système hôte est plus disposé à lire dans le vecteur que nous avons construit, afin qu'il puisse être traduit plus facilement en acides aminés, ce qui augmentera la vitesse de traduction et augmentera l'efficacité de l'expression des protéines.

2. Étiquettes de purification

Lorsque nous exprimons des protéines dans des micro-organismes, nous finissons généralement par purifier les protéines. Bien sûr, si vous n'utilisez que des extraits de cellules entières ou des extraits lysés, vous n'avez pas besoin d'envisager la purification des protéines.

Afin de réaliser la purification des protéines, nous devons ajouter des étiquettes de purification à la protéine. À l'heure actuelle, de nombreuses étiquettes de purification ont été systématiquement étudiées et appliquées dans la pratique. Les étiquettes de purification couramment utilisées incluent His tag, Strep-II tag, GST, Flat-Tag, etc.


3. Chaperons moléculaires et enzymes de pliage
Afin d'obtenir une protéine utile, il est très important de s'assurer que la protéine est correctement repliée. Afin d'aider la protéine à se replier correctement et à empêcher la formation de corps d'inclusion insolubles, nous avons besoin de vecteurs auxiliaires qui expriment des chaperons et des enzymes de repliement.

4. Emplacement de l'expression des protéines

Avant l'expérience, nous devons examiner où la protéine est exprimée, qu'elle soit sécrétée dans le cytoplasme, la substance intercellulaire ou extracellulaire.

Si une protéine contient des liaisons disulfure, nous ferions mieux de l'exprimer dans l'environnement oxydatif de la substance intercellulaire.

L'environnement oxydant peut aider les protéines à former les liaisons disulfure correctes pour obtenir la structure correcte.

Si vous souhaitez que la protéine soit exprimée à un emplacement spécifique dans la cellule ou sécrétée à l'extérieur de la cellule, vous devez ajouter un peptide signal à l'extrémité N-terminale de la protéine. À l'aide de peptides signaux, les protéines peuvent être transférées vers des emplacements spécifiques.


5. Voie d'expression des protéines

La sécrétion et l'expression des protéines présentent de nombreux avantages. D'une part, la sécrétion et l'expression de protéines peuvent réduire la toxicité et la charge métabolique des bactéries hôtes et augmenter l'adaptabilité des bactéries; en revanche, la teneur en protéines des bactéries hôtes dans l'espace périplasmique et dans le milieu extracellulaire est très faible, ce qui est propice à la purification de la protéine cible.

Différentes voies d'expression ont une grande influence sur l'efficacité de repliement des protéines.


6. Souche d'expression

Différentes souches d'Escherichia coli présentent de grandes différences dans les conditions de culture et les capacités d'expression de gènes étrangers. Par conséquent, la sélection de différentes bactéries hôtes joue un rôle essentiel dans l'accumulation des produits d'expression et la séparation et la purification en aval.

L'utilisation de souches mutantes défectueuses dans l'expression de la protéase peut augmenter la sécrétion et l'expression de protéines recombinantes.

Certaines souches défectueuses (telles que les mutants géniques qui synthétisent les éléments de la membrane externe) peuvent produire des protéines actives solubles avec une structure spatiale et des liaisons disulfure correctes, et peuvent éviter l'effet gênant de la paroi cellulaire dans le transport transmembranaire des protéines étrangères et faciliter la sécrétion de protéines recombinantes dans le milieu de culture.


7. Facteurs tels que milieu de culture, température, conditions d'induction, etc.

La composition du milieu, la méthode de culture, les conditions de culture et l'accumulation de métabolites inhibiteurs pendant le processus de culture affecteront l'expression et la sécrétion de protéines recombinantes dans les bactéries modifiées. Parmi eux, la composition nutritive du milieu, le pH et la température sont des facteurs importants qui affectent la croissance et l'expression des protéines étrangères des bactéries modifiées et peuvent affecter l'activité, la sécrétion et l'expression de la protéase.

L'ajout de glycine au milieu de culture peut favoriser la sécrétion de protéines de l'espace périplasmique vers l'extracellulaire sans provoquer d'autolyse des bactéries, et ne provoque pas de lyse bactérienne significative. L'ajout de gomme de sucre et de TritonX-100 au milieu peut empêcher la formation de corps d'inclusion dans la cavité périphérique et améliorer l'efficacité de l'expression extracellulaire.

La modification de la pression osmotique de l'induction de choc thermique à moyen et court terme et l'abaissement de la température pendant l'induction augmenteront considérablement l'expression soluble de la protéine recombinante dans E. coli.

De plus, pour les souches qui nécessitent une induction IPTG, le temps d'induction, la température et le temps de culture doivent être optimisés.


8. Temps de culture cellulaire

Un temps de culture cellulaire approprié est un facteur important qui détermine l'intégrité cellulaire et le niveau d'expression des protéines. Une longue période de culture cellulaire entraînera la lyse des cellules, la perte de la protéine cible et la libération de protéases toxiques.

La conséquence directe d'un temps de culture cellulaire trop court est que la concentration cellulaire n'est pas suffisante et que le rendement en protéine cible est trop faible. Par conséquent, le temps de culture des souches recombinantes doit être optimisé.